1795 begann er sein Studium an der philosophischen Fakultät der Prager Universität, welches er 1800 beendete. An der Universität wurde er von St. Vydra, einem Priester, der Mathematik unterwiesen, jedoch konnten seine Vorlesungen Bolzano weder beeindrucken noch zufriedenstellen. Sein zweiter Professor war F.J. Gerstner, ein vorzüglicher Mathematiker mit großem Weitblick. Gerstner konnte Bolzanos Begabung richtig einschätzen und beeinflussen.
1805 absolvierte er die theologische Fakultät, wurde zum Doktor der Philosophie und zum Priester geweiht. 1806 wurde er zum Professor der Religionslehre in Prag ernannt, nachdem der freigewordene Lehrstuhl für Elementarmathematik zu seinen Ungunsten besetzt worden war. Seine kritische Haltung zu gesellschaftlichen Normen brachten ihm viele Kritiker, die schon bald seine Absetzung verlangten. Parallel zu seiner Tätigkeit befaßte er sich sehr intensiv mit der Mathematik und schließlich brachte er 1810 in seiner Arbeit "Beyträge zu einer begründeteren Darstellung der Mathematik" seine Vorstellung vom Wesen und von der Methode der Mathematik zum Ausdruck. 1817 bewies er die Existenz von Wurzeln der algebraischen Gleichung, einen von Gauß mehrmals bearbeiteten Satz.
1818 wurde er Direktor der naturwissenschaftlichen Abteilung der Böhmischen Gesellschaft der Wissenschaften und am 24. Dezember 1819 wurde er durch Kaiser Franz seines Amtes enthoben, was er mit stoischer Ruhe zur Kenntnis nahm. Sofort nach seiner Entlassung begann er, sich ausschließlich mit wissenschaftlichen Fragen zu befassen.
Von 1819 bis 1823 lebte er in Radic bei Prag. 1820 wurde er der Universität verwiesen und unter Polizeiaufsicht gestellt. Von da an durfte er weder publizieren, noch journalistisch auftreten, noch im Staatsdienst arbeiten. 1824 weigerte er sich, seine Ansichten zu widerrufen und 1825 wurde der Prozeß gegen ihn eingestellt.
In dem 1837 erschienenen Werk "Wissenschaftslehre" erwies sich Bolzano als einer der Begründer der mathematischen Logik. Bolzano gab auch eine exakte Definition der Stetigkeit einer Funktion an, und zwar zeitlich vor Cauchy. Leider konnte er sein Werk "Größenlehre" nie beenden, in dem er sich vorgenommen hatte, wesentliche Teile der Mathematik zu einem logisch abgeschlossenen System zusammenzufassen.
1848 erkrankte er schwer und starb am 18. Dezember.
Im Jahre 1930 lieferte K. Rychlik mit der Herausgabe der "Functionenlehre" aus dem Nachlaß eine mathematisch-historische Sensation. Es zeigte sich nämlich, daß Bolzano - zeitlich weit vor Weierstraß und Riemann - als erster eine in einem ganzen Intervall stetige, aber dort nirgends differenzierbare Funktion konstruiert hatte.